UJI MIKROBIOLOGI BAHAN PANGAN

PRINSIP

1.    ALT

Pertumbuhan koloni bakteri dari sampel makanan / minuman  diinokulasikan pada media  lempeng  agar  NA dengan cara spread menggunakan ose L  kemudian di inkubasi pada suhu 37⁰C selama 24 jam.

2.    MPN

Uji penduga    : pertumbuhan bakteri dari sampel makanan/minuman  yang ditanam pada LB (Lactosa Borth) kemudian diinkubasi pada suhu 37⁰C selama 2 x 24 jam.

Uji penegas     : meneruskan pengujian penduga yang positif pada media Briliant Green Lactose Broth (BGLB) kemudian diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu.

3.    Uji Metabolisme Bakteri

Pertumbuhan bakteri gram positif dari sampel makanan/minuman diinokulasikan pada media BAP sedangkan bakteri gram negatif diinokulasi pada media MC, kemudian keduanya diinkubasikan pada suhu 37⁰C selama 24 jam.

DASAR TEORI

Berbagai macam uji mokrobiologis dapat dilakukan terhadap bahan pangan,  meliputi uji kuantitatif mikroba untuk menentukan daya tahan suatu makanan, uji kualitatif bakteri patogen untuk menenetukan tingkat keamanan dan uji indikator untuk menentukan tingkat sanitasi makanan tersebut. Pengujian yang dilakukan terhadap tiap bahan pangan tidak sama tergantung berbagai faktor, seperti jenis dan komposisi bahan pangan, cara pengepakan dan penyimpanan serta komsumsinya, kelompok konsumen dan berbagai faktor lainnya (Dirjen POM., 1979).

Metode MPN biasanya biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari contoh tersebut (Fardiaz, 1993).

Metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungannya dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung Durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentuk gas.

Dalam metode MPN, pengenceran harus dilakukan lebih tinggi daripada pengenceran dalam hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung satu sel, beberapa tabung yang lainnya mengandung lebih dari satu sel atau tabung lainnya tidak mengandung sel. Dengan demikian setelah inkubasi, diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung yang dinyatakan sebagai tabung positif, sedangkan tabung lainnya negatif.

Standar plate Count (Angka Lempeng Total) adalah menentukan jumlah bakteri dalam suatu sampel. Dalam test tersebut diketehui perkembangan banyaknya bakteri dengan mengatur sampel, di mana total bakteri tergantung atas formasi bakteri di dalam media tempat tumbuhnya dan masing-masing bakteri yang dihasilkan akan membentuk koloni yang tunggal (Djide M. Natsir., 2005)

Metode MPN merupakan uji deretan tabung yang menyuburkan pertumbuhan koliform sehingga diperoleh nilai untuk menduga jumlah koliform dalam sampel yang diuji. Uji positif akan menghasilkan angka indeks. Angka ini disesuaikan dengan tabel MPN untuk menentukan jumlah koliform dalam sampel. (Sesilia,R.2011)

Mikroba yang terkandung dalam makanan bisa menyebabkan terjadinya kerusakan mikrobiologis pada makanan sehingga tidak layak untuk dikonsumsi. Untuk mengetahui layak atau tidaknya suatu bahan makanan untuk dikonsumsi oleh masyarakat, perlu dilakukan pengujian mikroba yang terkandung dalam makanan tersebut, salah satu cara tersebut adalah dengan analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan (Buckle 1987). Cara ini sangat penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan. Banyak cara yang dapat dilakukan untuk mengetahui jumlah jasad  renik di dalam suatu suspensi atau bahan. Cara-cara tersebut dibedakan menjadi beberapa kelompok, yaitu:

A. Perhitungan jumlah sel

1.            Hitungan mikroskopis

2.            Hitungan cawan

3.            MPN (Most Probable Number)

B. Perhitungan massa sel secara langsung

1.            Volumetric

2.            Gravimetric

3.            Kekeruhan (turbidimeter)

C. Perhitungan massa sel secara tak langsung

1.            Analisis komponen sel (protein, DNA, ATP)

2.            Analisis produk katabolisme (metabolit primer, metabolit sekunder, panas)

3.            Analisis konsumsi nutrien (karbon, nitrogen, oksigen, asam amino, mineral).

(Waluyo 2007).

 Uji Angka Lempeng Total

Metode kuantitatif digunakan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada suatu sampel, umumnya dikenal dengan Angka Lempeng Total (ALT). Uji Angka Lempeng Total (ALT) dan lebih tepatnya ALT aerob mesofil atau anaerob mesofil menggunakan media padat dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati secara visual berupa angka dalam koloni(cfu) per ml/g atau koloni/100ml. Cara yang digunakan antara lain dengan cara tuang, cara tetes dan cara sebar (BPOM, 2008).

Prinsip pengujian Angka Lempeng Total menurut Metode Analisis Mikrobiologi (MA PPOM 61/MIK/06) yaitu pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah cuplikan diinokulasikan pada media lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai. Pada pengujan Angka Lempeng Total digunakan PDF (Pepton Dilution Fluid) sebagai pengencer sampel dan menggunakan PCA (Plate Count Agar) sebagai media padatnya. Digunakan juga pereaksi khusus Tri Phenyl tetrazalim Chlotide 0,5 % (TTC).

Prosedur pengujian Angka Lempeng Total menurut Metode Analisis Mikrobiologi (MA PPOM 61/MIK/06) yaitu dengan cara aseptik ditimbang 25 gram atau dipipet 25 ml sampel ke dalam kantong stomacher steril. Setelah itu ditambahkan 225 ml PDF, dan dihomogenkan dengan stomacher selama 30 detik sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10-1. Disiapkan 5 tabung atau lebih yang masing-masing telah diisi dengan 9 ml PDF. Hasil dari homogenisasi pada penyiapan sampel yang merupakan pengenceran 10-1 dipipet sebanyak 1 ml kedalam tabung PDF pertama, dikocok homogeny hingga diperoleh pengenceran 10-2. Dibuat pengenceran selanjutnya hingga 10-6 atau sesuai dengan pengenceran yang diperlukan. Dari setiap pengenceran

dipipet 1ml kedalam cawan petri dan dibuat duplo, ke dalam setiap cawan dituangkan 15-20 ml media PDA yang sudah ditambahkan 1%TTC suhu 45°C. Cawan petri segera digoyang dan diputar sedemikian rupa hingga suspense tersebar merata. Untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer dibuat uji kontrol (blangko). Pada satu cawan diisi 1 ml pengencer dan media agar, pada cawan yang lain diisi media. Setelah media memadat, cawan diinkubasi suhu 35-37°C selama 24-46 jam dengan posisi dibalik. Setelah itu jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung.

KEUNTUNGAN DAN KELEMAHAN DARI ALT

Keuntungan dari metode pertumbuhan agar atau metode uji Angka Lempeng Total adalah dapat mengetahui jumlah mikroba yang dominan. Keuntungan lainnya dapat diketahui adanya mikroba jenis lain yang terdapat dalam contoh.

Adapun kelemahan dari metode ini adalah :

1)      Kemungkinan terjadinya koloni yang berasal lebih dari satu sel mikroba, seperti pada mikroba yang berpasangan, rantai atau kelompok sel.

2)      Kemungkinan ini akan memperkecil jumlah sel mikroba yang sebenarnya. Kemungkinan adanya jenis mikroba yang tidak dapat tumbuh karena penggunaan jenis media agar, suhu, pH, atau kandungan oksigen selama masa inkubasi.

3)      Kemungkinan ada jenis mikroba tertentu yang tumbuh menyebar di seluruh permukaan media agar sehingga menghalangi mikroba lain. Hal ini akan mengakibatkan mikroba lain tersebut tidak terhitung.

4)      Penghitungan dilakukan pada media agar yang jumlah populasi mikrobanya antara 30 – 300 koloni. Bila jumlah populasi kurang dari 30 koloni akan menghasilkan penghitungan yang kurang teliti secara statistik, namun bila lebih dari 300 koloni akan menghasilkan hal yang sama karena terjadi persaingan diantara koloni.

5)      Penghitungan populasi mikroba dapat dilakukan setelah masa inkubasi yang umumnya membutuhkan waktu 24 jam atau lebih (Buckle, 1987).

Mac Conkey Agar (MCA)

Pembenihan ini bersifat selektif untuk hasil gram negatif, baik Enterobacteriateae maupunyang non fermented basilgram negative, sedangkan bakteri lain umumnya tidak tumbuh /tumbuh dengan tidak subur. Persenyawaan utama dalam media ini adalah laktosa, garamempedu dan nerah netral. Media ini menghambat pertumbuhan bakteri garam positif yangdisebabkan oleh garam empedu dan kristal violet, bakteri gram negatif yang tumbuh di bedakan dalam kemampuannya memfermentasekan aktosa. Koloni dari bakteri yangmemfermentasekan laktosa berwarna merah bata dan di kelilingi oleh endapan garamempedu. Endapan ini di sebabkan oleh penguraian laktosa menjadi asam yamg bereaksidengan garam empedu. Bakteri yang tidak memfermentasekan laktosa biasanya bersifat pathogen. Golongan bakteri ini tidak memperlihatkan perubahan pada media. Warna kolonidi lihat pada bagian koloni terpisah.

Blood Agar

Media ini di gunakan untuk menumbuhkan mikro organisme yang sulit untukdibiakan dan juga untuk membedakan kelompok mikroorganisme yang melisis atau tidakmelisiskan butir darah merah. Agar darah terdiri dari bahan dasar yang mengandung 5%darah domba. Lisis butir darah merah terlihat sebagai wilayah jernih di sekitar koloni. Bila proses lisis sempurna akan terlihat di wilayah yang benar-benar jernih dan jenis hemalisisnyadi sebut beta – hemolisis. Bila proses lisis tidak sempurna dan media berwarna kehijauanmaka jenis hemolisisnya di sebut Alpha Hemolisis. Bakteri yang tidak mampu melisiskan butir darah dan tidak menyebabkan perubahan nyata pada media tersebut disebut  gammahemolisi. Kelompok mikro organisme yang sering di bedakan berdasarkan kemampuanmelisiskan butir darah merah adalah sreptococcus dan staphylococcus, proses hemolisis disebabkan oleh enzim yang di lepas mikro organisme.

Alat dan Bahan

Alat :

Beaker glass

Mortar

Pinset

Tabung reaksi + rak

Pipet ukur

Ball pipet

Bunsen

Inkubator

Oven

Cawan petri

Ose bulat

Ose L

Bahan :

Sampel uji

Media NA

Media MC

Media BAP

Aquadest steril

Alkohol 70%

Kertas coklat

Cara kerja :

1.      Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

2.      Mengguanakan APD lengkap.

3.      Mengencerkan bahan pangan dengan pengenceran 10^-1, 10^-2, 10^-3.

4.      Masing – masing pengenceran ditanam pada media LB single sebanyak 1 ml dengan tabel MPN 3 3 3.

5.      Kemudian inkubasi pada suhu 37⁰C selama 48 jam.

      Jika media LB positif dilakukan uji selanjutnya yaitu uji penegas. Pada uji penegas ini bakteri yang telah tumbuh pada media LB ditanam di media BGLB dengan ose bulat, kemudian diinkubasi pada suhu  dan waktu tertentu, tergantung bakteri apa yang akan diketahui jika koliform non fekal menggunakan suhu 37⁰C selama24 jam sedangakan jika yang ingin diketahui bakteri koliforn fekal menggunakan suhu 44⁰C selama 24 jam.

Menanam di media NA, MC, BAP

1.    Pengenceran sampel 10^-1, ditanam pada media MC dan BAP dengan cara gores

2.    Pengenceran 10^-1 juga ditanam pada media NA dengan cara spread menggunakan ose L.

3.    Kemudian diinkubasi pada suhu 37⁰C selama 24 jam.

   Jika pada media MC atau BAP ditumbuhi bakteri, maka dilakukan pengecatan gram untuk mengetahui jenis bakteri yang tumbuh di media MC atau BAP.

Interpretasi Hasil         :

LB (+)                         : adanya perubahan warna merah menjadi kuning karna bakteri memfermentasikan laktosa dan terbentuknya gas >10% pada tabung durham.

BGLB (+)                   : adanya kekeruhan pada media dan terbentuknya gas >10% pada tabung durham.

NA, MC, BAP (+)      : ditumbuhi koloni bakteri.